تبلیغات
علوم آزمایشگاهی - آزمایشی در فضای تعلیق معرفی دستگاه الكتروفورز
 
علوم آزمایشگاهی
خاک شد هر که بر این خاک زیست / خاک چه داند که در این خاک کیست / سرانجام که باید در خاک رفت / خوشا آنکه پاک آمد و پاک رفت

آزمایشی در فضای تعلیق معرفی دستگاه الكتروفورز

آزمایشی در فضای تعلیق معرفی دستگاه الكتروفورز

 الكتروفورز از شناخته شده ترین روش های آزمایشگاهی برای جداسازی بیومولكول‌ها است. این روش در سال 1807 توسط Reuss كشف شد. او مشاهده كرد كه ذرات خاك رس تحت تاثیر میدان الكتریكی در آب پراكنده می شوند. به طور كلی الكتروفورز حركت ذرات پراكنده در داخل مایعی تحت تاثیر یك میدان الكتریكی یكنواخت است. همین حركت در فضایی با میدان الكتریكی غیر یكنواخت دی الكتروفورز نامیده می شود.

الكتروفورز بدین دلیل اتفاق می افتد كه ذرات معلق در مایع معمولا دارای بار الكتریكی سطحی هستند و میدان الكتریكی نیروی كولونی الكترواستاتیك به این ذرات باردار اعمال می‌كند. اخیرا شبیه سازی های دینامیك مولكولی، نظریه ای بیان داشته اند مبنی بر اینكه برای انجام الكتروفورز حتما نباید ذرات بار سطحی داشته باشند و حتی ذرات خنثی نیز به علت ساختار مولكولی خاصی كه آب به عنوان مایع واسط دارد، می توانند الكتروفورز شوند.
نیروی كولونی الكترواستاتیك اعمال شده به بار سطحی، با نیروهای مخالف الكترواستاتیك كاهش پیدا می كند. بر طبق تئوری لایه مضاعف، تمام سطوح بار دار در مایعات با لایه ای از بار مخالف پوشانده می‌شوند كه از نظر مقداری كاملا برابر با بار سطحی است اما با علامت مخالف آن. میدان الكتریكی همانند بار سطحی به این لایه نیرو وارد می كند. مجموع این نیروها برابر است با اولین نیروی نامبرده، اما در جهت مخالف آن. در حقیقت این نیرو به یون های موجود در لایه ثانویه اعمال می شود. این یون ها در فاصله ای از سطح ذره قرار می گیرند و بخشی از این نیروی الكترواستاتیك را از طریق تنش برش سیال به سطح ذره منتقل می‌‌كنند این بخش از نیرو كه به بدنه ذره وارد می شود، نیروی منفی الكتروفورتیك نامیده می شود.
یك نیروی الكتریكی دیگر نیز وجود دارد كه مرتبط با انحراف لایه ثانویه است و مربوط به تقارن كروی و رسانایی سطح است و به سبب زیادی یون ها در لایه ثانویه به وجود می‌آید. این نیرو نیروی تخفیف الكتروفورتیك نامیده می شود.
تمام این نیروها با اصطكاك هیدرودینامیك، به تعادل می‌رسند و باعث حركت ذرات در سیال می شود. سرعت این حركت v، متناسب با شدت میدان الكتریكی E است (البته در صورتی‌كه این میدان خیلی قوی نباشد.) ضریب این تناسب  تحرك پذیری الكتروفورتیك است كه رابطه بین شدت میدان الكتریكی و سرعت ذره را مشخص می نماید:

 

ماكرومولكول هایی مانند اسید نوكلئیك، DNA و پروتئین ها نیز باردار هستند و می‌توان با قرار دادن آن‌ها در یك میدان الكتریكی، بر مبنای خاصیت الكتروفورز آن‌ها را تفكیك كرد. سرعت حركت مولكول‌ها در این شرایط نه تنها تحت تاثیر بار الكتریكی و شدت میدان الكتریكی است، بلكه عواملی نظیر اندازه، وزن مولكولی و شكل فضایی مولكول نیز در این امر دخیل هستند. همچنین اثرات محیطی نظیر نوع و نحوه استفاده از بافرها و حرارت ایجاد شده در حین كار نیز از عوامل موثر بر جداسازی مولكول‌های نمونه هستند. معمولا الكتروفورز برای تفكیك مولكول‌های بزرگی چون پروتئین ها و اسیدهای نوكلئیك به كار برده می شود، اما در مواردی نیز برای جداسازی مولكول‌های باردار كوچك‌تر نظیر قندها، اسیدهای آمینه، پپتیدها و حتی یون‌های ساده مورد استفاده قرار می گیرد.
در طی قرن 20 میلادی چندین تئوری برای محاسبه این پارامتر به وجود آمده اند. كه مهم‌ترین آن‌ها نظریه Smoluchowski در سال 1903 میلادی بود.
Arne Tiselius
در سال 1948 به خاطر زحماتی كه برای الكتروفورز و آنالیز جذبی كشید برنده جایزه نوبل شد و از این رو او را پدر الكتروفورز نامیدند. اولین الكتروفورز نیز الكتروفورز بدون مرز تیسلیوس نام داشت كه به وسیله آن محلول های پروتئینی غلیظ را در یك تیوب U شكل بزرگ كه به وسیله بافر پوشانده شده بود، مورد آزمایش قرار می دادند. این روش الكتروفورز بسیار مشكل بود، به همین دلیل در سال 1950 تغییراتی در عملكرد آن اعمال شد. ابتدا از فیلترهای كاغذی و استات سلولز استفاده می شد، اما به دلیل ظرفیت محدود و رزولوشن پایین این مواد، جای خود را به ژل دادند. ژل های استفاده شده در آن زمان به علت بزرگ بودن خلل و فرج ها قادر نبودند پروتئین ها را به تفكیك سایز جداسازی كنند، از این رو به تدریج به ژل هایی چون آگاروز دست یافتند.

 

 

 

 

 

 

 

امروزه الكتروفورز ژلی از بخش های جدا ناپذیر هر تحقیق و فعالیت های آزمایشگاهی به منظور جداسازی ماكرومولكول‌هااست. محدوده وسیعی از فعالیت های آزمایشگاهی تحقیقاتی و كلینیكی مانند تسلسل ژن ها، جداسازی كروموزوم ها، جداسازی و تعیین خصوصیات پروتئین ها توسط این روش انجام می گیرد. علاوه بر این، استفاده از الكتروفورز از مرز آزمایشگاه‌ها فراتر رفته و به عنوان شاهدی برای وكلا، قضات و هیات منصفه در امور قضایی محسوب می‌شود. تشخیص هویت DNA به خصوص در موارد تعویض نوزاد در بیمارستان ها و تعیین والدین فرد كاربرد بسیاری در علوم ژنتیك پیدا كرده است.
در حال حاضر آگاروز و پلی كریل آمید متداول ترین و پر كاربردترین ماده به عنوان واسط در الكتروفورز ژلی محسوب می شوند. در اغلب دستگاه‌های الكتروفورز، ژل مابین دو محفظه بافری قرار می گیرد به طوری‌كه ژل تنها واسطه در عبور جریان الكتریسیته بین این دو محفظه باشد. هر دو شبكه خلل و فرج داری تولید می كنند كه میكرومولكول‌هایی بارداری را كه در پاسخ به میدان الكتریكی جابه جا می شوند در خود جای می دهند. به عنوان مثال زمانی كه جریان اعمال می شود، DNA های با بار منفی به سمت الكترودهای باردار مثبت حركت می كنند. خلل و فرج های موجود در شبكه ژلی انتقال مولكول‌های بزرگ را محدود می كنند و این در حالی است كه مولكول‌های كوچك‌تر با آزادی بیشتری منتقل می شوند و در فاصله دورتری از الكترودها قرار می گیرند. این غربال مولكولی مولكول‌ها را بر مبنای سایزشان جدا می كند. همچنین می توان مولكول ها را بر مبنای بار اولیه ای كه داشتند جداسازی كرد. مولكول‌هایی كه بار بیشتری دارند تحرك الكتروفورزی بیشتری از خود نشان می‌دهند و سریع‌تر منتقل می شوند بدین ترتیب درون ژل با اولویت باری كه داشتند قرار می‌گیرند. جداسازی بر مبنای بار به ژلی نیاز دارد كه مانند آگاروز دارای خلل و فرج های بزرگ‌تری باشند. آگاروز برای جداسازی اسید نوكلئیك ها و پروتئین های خیلی بزرگ یا تركیب ها استفاده می شود. آگاروز یك پلی ساكارید طبیعی است كه از نوع خاصی جلبك دریایی قرمز به دست می آید. زمانی كه گرما داده شده و سپس سرد می‌شود به صورت جامد متخلخلی با خلل و فرج های نسبتا بزرگ تبدیل می‌شود. الكتروفورز ژل آگاروز (AGE)‌ را می توان برای جداسازی مولكول‌ها بر مبنای بار یا وزن مولكولی‌شان استفاده كرد. یكی از مهم‌ترین كاربردهای AGE جداسازی بخش های حاصل از برش DNA با آنزیم های محدودكننده است.
در طی انجام الكتروفورز ثابت نگاه داشتن حرارت اهمیت بسیاری دارد چرا كه به حفظ تكرار پذیری آزمایش كمك می كند. به عنوان مثال پلیمریزه شدن آكریل آمید یك واكنش گرمازا است و گرمای حاصله به خصوص در مورد ژل های غلیظ تر، ممكن است باعث بروز بی نظمی در اندازه ی منافذ ژل شود. انتقال گرما معمولا مشكلی در ژل هایی با غلظت كمتر از %15 T ایجاد نمی‌كند. البته ممكن است بالا رفتن دما مشكلات دیگری چون شكستن شیشه های الكتروفورز و آسیب به دستگاه را منجر شود. پروتئین‌ها به علت خصوصیت آمفوتری خود تحت تاثیر pH محیط بارالكتریكی خاص خود را نشان می دهند. بدین علت در جداسازی توسط الكتروفورز باید pH محلول های  مورد استفاده ثابت باقی بماند. از آنجا كه الكترولیز آب در آند یون‌ای "H+" و در كاتود یون‌های "OH-" ایجاد می‌كند، برای ثابت نگاه داشتن  pH محلول‌های مورد استفاده، باید آن‌ها را بافر كرد.

 

 

 

 


 
نوع دیگری از الكتروفورز، الكتروفورز مویین (CE)‌ است. این تكنیك كه عمده ترین كاربرد آن در شیمی دارویی و درمانی است، برای جداسازی مولكول‌های درشت و ریز در مجاری بسیار نازك (با قطر داخلی 200-20میكرومتر) استفاده می شود. در این روش، جداسازی با ولتاژ بالا kV) 30-10) امكان پذیر می‌شود. از محاسن CE   می توان به سرعت دستیابی به نتیجه در آنالیز یون ها اشاره كرد. به طور كلی CE بیشتر زمانی مطرح می شود كه با آنالیت های باردار با پلاریته و قطبیت زیاد سر و كار داریم. این تكنولوژی در علوم بایوتكنولوژی جایگاه ویژه ای پیدا كرده و در آنالیز ماكرومولكول‌هایی چون پروتئین ها و كربوهیدرات‌ها جایگزین خوبی برای الكتروفورز سنتی به شمار می رود. همچنین تكنولوژی CE برای سرعت بخشی به رشد علم ژنتیك به خدمت گرفته شده است. استفاده از الكتروفورز موئین در علوم تحلیلی به خصوص در زمینه دارویی و زهر شناسی رشد بسیاری داشته است.
الكتروفورز موئین در بر گیرنده چندین تكنیك است كه عملكرد و مشخصه های متفاوتی با هم دارند. این تكنیك ها كه به مودهای الكتروفورز موئین معروف هستند عبارتند از: الكتروفورز ناحیه ای موئین (CZE)‌، تمركز ایزوالكتریك‌ (IEF)، الكتروفورز موئین ژلی، ایزوتاكوفورز‌ (ITP) و كروماتوگرافی الكتروسینتیك موئین.
نوع دیگری از الكتروفورز كه قدیمی ترین نوع این تكنیك محسوب می شود، الكتروفورز سطحی نام دارد. در این روش از یك لایه كاغذی متخلخلی با طول 10-20 سانتیمتر، ترموپلاستیكی متشكل از سلولز و اسید استیك و ژل پلیمر استفاده می شود.
تشخیص هویت DNA به‌ وسیله الكتروفورز، اندازه گیری هر رشته و شمارش تعداد بخش ها و برش های تكرار شده در آن است. دانشمندان برای این كار از روش الكتروفورز ژلی استفاده می كنند. بدین ترتیب كه با جریان الكتریكی رشته های DNA را از میان ژل  عبور می دهند. چون هر بیت از DNA دارای بار منفی است و در معرض نیروی الكتریكی با بار برابر قرار می گیرد و آن را به سمت وجهی از ژل كه بار مثبت دارد، پیش می برد. ذرات كوچك‌تر سریع‌تر حركت می كنند. وقتی جریان برداشته می شود، از ژل تصویری گرفته می شود تا مشخص شود هر بیت چه قدر جابه‌جا شده است. با مقایسه باندهای ایجاد شده با نمونه های استاندارد كه سایزهای شناخته شده ای دارند، طول هر بخش از DNA به دقت اندازه گیری می شود.

 





نوع مطلب : آزمایش، 
برچسب ها :
لینک های مرتبط :
1396/06/18 05:11
Hi there, You have done an excellent job. I will
certainly digg it and personally suggest to my friends. I'm sure they will be benefited
from this site.
1396/02/25 03:44
Greetings! Very helpful advice in this particular post!

It's the little changes that make the most important changes.
Many thanks for sharing!
1396/02/7 11:35
Simply wish to say your article is as surprising. The
clearness in your submit is just nice and that i can assume you
are a professional on this subject. Fine together with your permission allow me to grab your
feed to stay up to date with impending post. Thank you a million and please keep up the enjoyable work.
1396/02/2 20:32
hey there and thank you for your info – I have definitely picked up
anything new from right here. I did however expertise several technical issues
using this web site, as I experienced to reload the web site lots of times previous to I could get it to load correctly.
I had been wondering if your web hosting is OK? Not that I am complaining, but slow loading instances times will often affect your placement in google and can damage your high-quality score
if ads and marketing with Adwords. Well I'm adding this RSS to my email and can look
out for much more of your respective interesting content.
Ensure that you update this again soon.
1388/09/29 15:15
خیلی عالی بود
 
لبخندناراحتچشمک
نیشخندبغلسوال
قلبخجالتزبان
ماچتعجبعصبانی
عینکشیطانگریه
خندهقهقههخداحافظ
سبزقهرهورا
دستگلتفکر


آمار وبلاگ
  • کل بازدید :
  • بازدید امروز :
  • بازدید دیروز :
  • بازدید این ماه :
  • بازدید ماه قبل :
  • تعداد نویسندگان :
  • تعداد کل پست ها :
  • آخرین بازدید :
  • آخرین بروز رسانی :